Analiza toksykologiczna peptydów w materiale biologicznym z wykorzystaniem spektrometrii mas na przykładzie oznaczania alfa-amanityny

Tomasz Janus, Ewa Jasionowicz, Barbara Potocka-Banaś, Krzysztof Borowiak

Abstrakt


Wstęp: Rutynowa analiza toksykologiczna materiału biologicznego obejmuje najczęściej badania w kierunku identyfikacji związków o różnym charakterze, właściwościach i budowie organicznej lub nieorganicznej, jednak o masie nieprzekraczającej 500–600 Da. Większość związków organicznych to cząstki o stosunkowo niewielkiej masie. Zupełnie odmienną grupą analityczną są związki o budowie peptydowej i masie przekraczającej 900 Da, będące składnikami wielu toksyn, szczególnie grzybów kapeluszowych czy jadów zwierzęcych. Celem pracy było przedstawienie analitycznej specyfiki związków o strukturze peptydowej na przykładzie alfa-amanityny, oznaczanych w powszechnie stosowanych układach LC-MS/MS, na podstawie badań własnych.

Materiały i metody: Materiał badawczy stanowił mocz pobierany od pacjentów w ramach rutynowej diagnostyki zatruć grzybami, analizowany pod kątem obecności alfa-amanityny. Mocz poddany został ultrafiltracji na filtrach wirówkowych o odcięciu masowym 3 kDa; przesącz poddano bezpośredniej analizie chromatograficznej z detekcją mas.

Wyniki: Peptydy jako grupa związków organicznych wykazujących właściwości amfoteryczne przy stosunkowo dużej masie cząsteczkowej mogą być ekstrahowane w układzie fazy stałej, jednak na dedykowanych kolumnach. W pracy wykazano, iż zastosowanie ultrafiltracji na etapie przygotowania próbek do analizy pozwala na skuteczną izolację alfa-amanityny, przy zachowaniu wymaganej czułości oznaczenia i ograniczeniu wpływu matrycy na sprawność układu analitycznego. Specyfiką peptydów jest także ich mało charakterystyczna fragmentacja, skutkująca jedynie intensywnym sygnałem o masie M-18 Wykorzystanie tego przejścia masowego w trybie pomiaru MS/MS nie pozwala jednak na uzyskanie całkowicie selektywnego chromatogramu. Zastosowanie wyższych energii kolizyjnych prowadzi do uzyskania bardziej charakterystycznego widma masowego, jednak skutkuje to jednoczesnym spadkiem czułości oznaczenia.

Wnioski: Ultrafiltracja jako etap przygotowania próbek w analizie alfa-amanityny jest efektywną metodą izolacji peptydów z matrycy. Monitoring przejścia masowego w trybie MS/MS z utratą cząsteczki wody pozwala na uzyskanie wysokiej czułości oznaczenia.


Słowa kluczowe


alfa-amanityna; peptydy; LCMS

Pełny tekst:

PDF

Bibliografia


Machoy-Mokrzyńska A, Potocka B, Borowiak K. Podstawowe pojęcia toksykologiczne, drogi narażenia, losy trucizny w ustroju, odtrutki. In: Borowiak KS, Machoy-Mokrzyńska A, editors. Wybrane zagadnienia z toksykologii ogólnej i ostrych zatruć. Szczecin: Wydawnictwo Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie; 2003. p. 6–9.

Ba dcock NR. Detection of poisoning by substances other than drugs: a neglected art. Ann Clin Biochem 2000;37(2):146-57.

Bonk T, Humeny A. MALDi-TOF-MS analysis of protein and DNA. Neuroscientist 2001;7(1):6-12.

Wieland T, Faulstich H. Amatoxins, phallotoxins, phallolysin and antamanidine: the biologically active components of poisonous Amanita mushroom. CRC Crit Rev Biochem 1978;5(3):185-260.

Wieland T. The toxic peptides from Amanita mushrooms. Int J Pept Protein Res 1983;22(3):257-76.

Meyers A, Trauger S, Webb W, Reisdorph N, Wranick C, Peters E, et al. Protein identification and profiling with mass spectrometry. Spectroscopy 2003;17:1-15

Dorizzi R, Michelot D, Tagliaro F, Ghielmi S. Methods for chromatographic determinations of amanitins and related toxins in biological samples. J Chromatogr 1992;580(1-2):279-91.

Domon B, Aebersold R. Mass spectrometry and protein analysis. Science 2006;312:212-7.

Finoulst I, Pinkse M, van Dongen W, Verhaert P. Sample preparation techniques for the untargeted LC-MS-based discovery of peptides in complex biological matrices. J Biomed Biotechnol 2011; 245291. doi: 10.1155/2011/245291.




DOI: https://doi.org/10.21164/pomjlifesci.180

Copyright (c) 2016 Tomasz Janus, Ewa Jasionowicz, Barbara Potocka-Banaś, Krzysztof Borowiak

URL licencji: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pl/